物种基因剔除技术爆炸性的新突破─ CRISPR-Cas9技术浅谈

浏览:701时间:2020-07-23
 前传─故事得从「基因剔除鼠」开始讲起⋯

物种基因剔除技术是生命科学研究上的一种终极手段,用来了解特定基因在生命发展过程当中扮演的角色。就如你对别人的好,往往都是你不在身边时,别人才有清楚的感受一样,透过抑制特定基因表现的手段,我们可以藉由观察胚胎或动物生理上的变异情形,进而了解该基因的运作。想要在动物身上进行基因剔除,最着名的莫过于「基因剔除鼠」(knockout mice)的技术。这个运用基因同源性重组(homologous recombination)的原理,以及胚胎干细胞(embryonic stem cells)培养 所组合而成的庞大生物工程,在发展的三十余年间,满足了科学家们对研究上的需求。据悉,到目前为止, 科学家们透过这个技术在老鼠的基因体(genome)当中,研究了逾半(约1万多个)的基因,对人类生命科学的贡献难以计数。也因此,在2007年的诺贝尔生医奖,特别授与当初提出相关构想的卡佩奇(Mario Capecchi)等三位教授。

就科学与技术的角度来看,基因剔除鼠的研究设计十分完美,科学家们得以运用分子生物学研究工具,精确的掌握实验的每一个阶段,过程透明,没有灰色地带。若说有甚幺问题的话,我想应该是複杂的工序、过高的技术门槛以及庞大资金的需求,这使得基因剔除鼠沦为大型实验室专属的研究工具,成为研究奢侈品。直至目前为止,一件订製基因剔除鼠的专案,价格仍高达15 万美元,所以市场上仍有一大部分的研究需求无法由基因剔除鼠技术获得。在2010年前后所发表的CRISPR/Cas9物种基因剔除技术,恰恰弥补了市场需求上的不足,所以短短五年的时间内即有爆炸性的发展,成为学术界的新趋势。

两项重要关键

在进一步谈论主题前,我首先解释一下物种基因剔除技术在发展上的两项重要关键,分别为(1)具有找到目标基因的方式(gene targeting),(2)具有破坏或取代目标基因的方法。在基因剔除鼠的技术当中,科学家们用一段与目标基因「相似但不完全相同」的DNA补丁(patch)与目标基因互换, 藉此来改变目标基因的表现,而近年来的新兴基因 剔除技术,主要是利用源自原核生物体内的一些 DNA内切酶(如后文的Cas蛋白)攻击特定DNA 所产生的破坏来达到类似的效果。基因剔除鼠的同 源性重组原本就是一种具有专一性置换的方法,缺点是成功机率很低,约只有百万分之一,所以科学家们巧妙的整合胚胎干细胞的培养、基因转殖以及细胞筛选的手段来提升成功机率。而新的方法中则 历经锌指核酸酶(ZFN)与类转录活化因子核酸酶 (TALEN)技术,终至CRISPR/Cas9技术始大放 异彩。基因剔除鼠与CRISPR/Cas9技术之间的差 异,在表一中做了整理,方便读者参考。
 表一:基因剔除技术大PK。
物种基因剔除技术爆炸性的新突破─ CRISPR/Cas9技术浅谈
 
本篇─在细菌身上所发现的免疫机制

CRISPR/Cas9的全名为「常间回文重複序列丛集关联蛋白」(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ CRISPR associated protein 9),这个名称主要是源自细菌以及古菌身上的免疫系统。目前我们所理解的运作方式如图一,主要是对抗外来DNA(如噬菌体)的入侵,Cas蛋白会辨认外 来DNA上的特徵,然后将其水解消灭。不过,故事并非到此结束,为了增进抗病的效率,多数的免疫系统均会发展它们独特的「记忆」,CRISPR 系统也不例外, 外来病源DNA并不会完全被水解殆尽,而是经过加工后,被镶嵌在细菌自己的基因体中。这个称为CRISPR array的特殊区段能够转录,成为一张「嫌犯名单」,而系统中的Cas III蛋白则会利用这些RNA片段去辨认 可疑的DNA片段,并消除吻合序列的目标。
 整个机转中,Cas III蛋白的独特能力受到科学家们的 青睐,很适合作为物种基因剔除技术的元件,其中Cas9 蛋白最为常用,CRISPR/Cas9的名称便是由此而来。
物种基因剔除技术爆炸性的新突破─ CRISPR/Cas9技术浅谈
图一:细菌中CRISPR/Cas9的免疫防御机制。
双股 DNA 断裂的修复机制

简单的说,CRISPR/Cas9技术就是利用Cas9蛋白质 可切割特定的基因,来达到基因剔除。不过,单单切割 DNA,就可以抑制DNA表现吗?对细胞来说,双股 DNA断裂是一种严重的伤害,细胞必定会执行修复, 想要完整修复,需要有适合的「参考範本」,像是双股DNA的对向互补股,我们相信,在演化上,DNA以双 股螺旋方式存在的道理源自于此。当DNA的双股同时 断裂,将会失去DNA讯息的连续性,这就成为一个棘手的问题,目前已知细胞可经由两种途径进行修复(图二)。传统的途径称为双股同源互换(homologous recombination),主要是向另一条同源染色体「借」 一股DNA作为参考基础(模板),然后完美修复受损 的DNA;不过本文关注的焦点,是另一套系统,称为非同源互换端点黏合系统(non-homologous end joining, NHEJ)。相较于前者,这套系统的修复显得有些草率,它藉由特殊蛋白质结合上双股DNA断裂的断口,然后把这些DNA「黏起来」,中间并不包括去 辨认任何的DNA序列。即便NHEJ系统听起来十分粗糙,事实上这是因应危机处理上的权宜之计,在细胞分 裂的状况下,发生双股断裂会造成複製的染色体无法完 全分配。因为NHEJ系统草率的修复,所以很多时候 会在断口附近遗失一到数个DNA分子,形成「缺失」 (deletion)突变。如果接点在某个基因当中,缺失突变可能会发生密码子的「框架移动」(frameshift), 意思是,这个基因无法合成对应的蛋白。物种基因剔除技术爆炸性的新突破─ CRISPR/Cas9技术浅谈 图二:CRISPR/Cas9攻击目标DNA所诱发之DNA修补机制的可能结果。
CRISPR/Cas9技术的原理,就是藉由Cas9蛋白攻击目标基因,诱发细胞体内的双股DNA修补之后产生有瑕疵的修复结果,因而达成基因剔除。

CRISPR/Cas9技术应用上的优缺点

其实就方法学上,利用新的基因寻标(gene targeting)以及藉由酵素攻击特定基因诱发细胞NHEJ的不完美修复的设计,都并非为CRISPR/Cas9 技术首创,早期的锌指核酸酶(ZFN)以及类转录活 化因子核酸酶(TALEN)的技术,均有相似的概念,尤其TALEN对目标基因的精确度,至今仍为其他新兴方法所难望项背。CRISPR/Cas9技术之所以会受到相当的青睐,主要的理由是因为它採用核酸作为辨认目标基因的工具,这使得实验操作成本得以大幅度的降低。针对特定基因来製备TALEN对应蛋白,合成费用约需1万美元,但使用CRISPR/Cas9技术,成本可以下降到1000美元。而且CRISPR/Cas9技术在目标基因序列上的宽容度更高,不会受限于某些DNA序列的组合。由于并不需要使用胚胎干细胞,这使得包括 CRISPR/Cas9技术在内的新兴基因剔除技术可以广泛的运用在各种生命体当中,并不像基因剔除鼠技术只能在小鼠当中进行。

听起来,新兴技术似乎十分的美好,不过这些方法也不是没有「死穴」,它们最大的问题在于过程的不透明。 如前文所述,基因剔除鼠是以一段DNA补丁置换的方式处理成不活化的基因,特殊的DNA可以利用聚合酶链锁反应法(PCR)验证小鼠身上是否具有这样的补丁,来确认实验的成功性。而CRISPR/Cas9技术的验证方式,除了在基因接合位置附近的缺失之外,并不会有其它外加的DNA序列标记可作为后续PCR检验的基础,当在讨论「脱靶」的可能性时,这项弱点使得证据力变得更加的薄弱。所谓「脱靶」,是指除了在目标基因之外,Cas9攻击其他基因的可能性,这点在基因剔除鼠的研究中很容易被证明,但在这些新兴的方法中,简直有如海底捞针般困难。

结语─学术界的阶级革命 CRISPR/Cas9技术从2010年被提出后,在短短的数年间即成为学术研究上的主流,除了方便操作、价格便宜之外,更具象的,它掀起了生命科学学术界的一场阶级革命:原本只属大型实验室才能负担的物种基因剔除研究,转而成为普遍研究室都可以进行的实验。资源、财力以及技术门槛在此一举被攻破,我想这是 CRISPR/Cas9技术在最近能如此窜红的主因。

基因剔除鼠以及CRISPR/Cas9技术有如光谱的两端, 一端以精确透明的实验流程见长,另一端则以价格优势、低技术门槛取胜。你,会想用哪种方法呢?